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　　以AlphaFold为代表的蛋白质三维结构计算预测方法引领了人工智能在生命科学研究中的革命性发展，该领域的三位先驱科学家也于今年获得了诺贝尔化学奖。而膜蛋白在细胞表面发挥关键作用，它们不仅参与细胞与外界环境的物质交换和信号传递，还负责细胞间的识别、粘附以及细胞内部的多种生物学过程。下一步，人工智能如何发现膜蛋白的新功能，进一步更广泛更深入地引领生物医学的新突破，本期解读的论文提供了很好的范例与启发。

　　受精是有性生殖的基础，涉及和卵子的识别、结合和融合。这一过程对于包括我们人类的所有有性繁殖生物体都是至关重要的。在分子层面上，受精涉及到复杂的分子识别和细胞融合事件，这些事件确保遗传物质的成功传递给下一代。

　　尽管受精的重要性不言而喻，但我们对其分子机制的理解仍然有限。在脊椎动物中，和卵子的结合依赖于特定的分子相互作用，包括表面的蛋白质与卵子表面的膜蛋白之间的识别和结合。这些分子事件触发了与卵子的融合，最终导致了受精卵的形成。尽管在过去的二十年中，科学家们发现了几种哺乳动物中精卵相互作用的必需蛋白如Izumo1和JUNO1，但精卵结合过程中未知的因素很多，其分子机制也尚不清楚。

　　基于现有的知识，科学家们提出了一个假设：细胞膜上可能存在一个由多个蛋白质组成的复合体，这些蛋白质共同参与了与卵子的结合过程。这个假设是基于观察到的表面蛋白质之间的相互作用，以及它们在不同物种中的保守性。如果这个复合体确实存在，那么它可能在不同物种的受精过程中发挥着核心作用。

　　这样的假设在最近得到了验证。2024年10月17日，来自维也纳生物中心（Vienna BioCenter）的科学家们在《Cell》杂志发表了题为“A conserved fertilization complex bridges sperm and egg in vertebrates”的研究论文，揭示了脊椎动物中和卵子结合的新型分子机制。他们通过基于人工智能的AlphaFold-Multimer预测和实验验证，发现了一种保守的复合体，该复合体由三种蛋白质Izumo1、Spaca6和Tmem81组成，它们在和卵子的结合过程中起到桥梁作用（图1）。

　　为了发现脊椎动物中与四种已知保守的受精因子（Izumo1、Spaca6、Dcst1和Dcst2）的潜在结合蛋白，研究人员首先收集了已知的受精因子蛋白质序列，也创建了一个包含了约1400个斑马鱼睾丸表达的分泌型/膜蛋白的候选蛋白库。他们使用AlphaFold-Multimer这一基于人工智能的蛋白质结构和相互作用预测工具3，以这些蛋白作为“诱饵”，进行与候选蛋白库中的蛋白质之间的相互作用预测。AlphaFold-Multimer通过结构预测方法来预测蛋白质-蛋白质之间的相互作用。在预测结果中，Izumo1与Spaca6和Tmem81之间的相互作用得到了高分（图2），表明它们可能在结构上相互靠近。通过进一步的分析，发现Tmem81是一个在中表达的单次跨膜蛋白，虽然前人的研究并未发现其与受精过程有明确关联。long8国际官方网手机版app

　　在发现了Izumo1与Spaca6和Tmem81之间两两互作的基础上，研究人员进一步用AlphaFold-Multimer预测了斑马鱼Izumo1、Spaca6和Tmem81的三元复合物结构，并对其结构模型进行了评估。预测的复合物结构显示了这些蛋白质之间的直接相互作用，它们的免疫球蛋白（Ig）样结构域错开排列，使得N端结构域面向胞外空间。预测结果显示，这三个蛋白质的Ig样结构域和跨膜区形成了紧密的相互作用，包括氢键、疏水作用和离子键等。预测还显示了这些蛋白质之间具有电荷互补性，这进一步支持了该三元复合物模型的稳定性。因此，基于这些预测结果，研究人员提出了一个假设：Tmem81 是一种重要的受精因子，在脊椎动物的受精过程中通过与Izumo1和Spaca6形成三聚体来发挥作用。

　　为了验证Tmem81的在受精与生育中的作用，研究人员在斑马鱼和小鼠中通过CRISPR-Cas9技术敲除了Tmem81基因。结果显示，缺乏Tmem81的雄性动物无法生育，而雌性动物的生育能力则未受影响。这一结果表明Tmem81对于的功能至关重要。进一步的实验显示，在斑马鱼中，tmem81敲除的虽然具有正常的运动能力，但无法稳定地粘附到去壳的斑马鱼卵子上。在小鼠中，Tmem81敲除的虽然具有正常的形态和运动能力，但无法在体外使卵子受精。

　　该研究也分析了Tmem81在不同组织中的表达模式。通过RNA测序数据分析，研究人员发现tmem81在成年斑马鱼的睾丸中特异性表达。在小鼠中，Tmem81的表达在发生过程中的中期圆形细胞中达到高峰。此外，通过western blot，他们还发现糖基化的TMEM81在人类中也有表达。

　　研究人员发现，Tmem81-Izumo1-Spaca6三元复合体的稳定性对于其功能至关重要。在斑马鱼中，当任何一个复合体成员缺失时，其他成员的稳定性也会受到影响，导致整个复合体的解体。这表明这些蛋白质之间存在着相互依赖的关系，共同维持着三聚体复合体的结构和功能。在哺乳动物中，虽然这种依赖性不是那么的明显，但三聚体复合体的形成对于的功能仍然是必需的。

　　为了直接探究预测的分子相互作用，研究者们进行了共免疫沉淀（coIP）实验，并通过质谱分析来鉴定相互作用的蛋白质。结果显示，Izumo1、Spaca6和Tmem81在中的相互作用是稳定的，并且这种相互作用在的成熟过程中是必需的。这些结果表明，三元复合体的形成对于的稳定性和功能至关重要。

　　图4. 共免疫沉淀实验显示人体中同源的Tmem81与Izumo1、Spaca6的稳定互作

　　研究人员发现，这个三元复合体在表面的特定区域形成了一个结合位点，这个位点能够与卵子表面的蛋白质Bouncer或JUNO相互作用。在斑马鱼中，通过AlphaFold-Multimer预测，他们发现Bouncer能够与三元复合体的特定区域结合，这一结合位点位于Izumo1和Spaca6的四螺旋束（4HB）之间的裂隙中。

　　为了验证这一预测，研究人员利用昆虫细胞表达了重组的Bouncer蛋白，并将其与三元复合物进行了结合实验。结果显示，加入重组Bouncer蛋白能够特异性地抑制斑马鱼的体外受精过程。此外，他们还在HeLa细胞中表达了三元复合物，并发现这些细胞能够特异性地结合Bouncer蛋白。这些结果表明，三聚体复合体能够作为Bouncer的受体，从而在和卵子之间架起一座桥梁。

　　而在哺乳动物中，三元复合物则与JUNO相互作用。通过AlphaFold-Multimer预测，研究人员发现JUNO能够与三元复合物的特定区域结合，这一结合位点位于Izumo1的铰链区域，与Bouncer的结合位点不同。

　　该研究还探讨了三聚体复合体在不同物种中的进化意义。尽管卵子表面的受体蛋白在不同物种中有所不同，但表面的该三元复合体在进化上是保守的。这种保守性可能反映了一种古老的受精机制，其中通过一个通用的复合体与卵子表面的不同受体相互作用，以实现受精。这种机制的发现，为我们理解不同物种间受精过程的相似性和差异性提供了新的线索。

　　总之，这项研究通过结合人工智能的蛋白质多元复合物预测和实验验证，揭示了脊椎动物和卵子结合的分子基础，为生殖生物学领域提供了重要的新知识。基于膜蛋白Tmem81和其它复合物成员在功能中的关键作用，它们可能成为未来治疗男性不育的靶点，也有望通过靶向这些蛋白实现在辅助生殖中提高受精率。

　　更广泛地看，膜蛋白在药物研发中发挥着核心作用，它们不仅是许多疾病治疗的关键靶点，而且其结构和功能特性对于药物设计、筛选、作用机制的解析以及药物安全性和疗效评估至关重要4。通过将以AlphaFold为代表的人工智能技术更深入地应用于膜蛋白领域，必将进一步推动相关基础研究、药物研发和临床应用的不断创新与蓬勃发展。

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